מצוות הבדלה היא לדעת הרמב"ם (שבת פרק כט הלכה א) מצווה מן התורה, שנאמר (שמות כ ז) 'זָכוֹר אֶת יוֹם הַשַּׁבָּת לְקַדְּשׁוֹ', כלומר זכרהו זכירת שבח וקידוש, וצריך לזכרהו בכניסתו וביציאתו, בכניסתו בקידוש היום וביציאתו בהבדלה. גם לדעתו, אין חובה מן התורה להבדיל על כוס יין. אף לדעת ראשונים אחרים, המובאים במגיד משנה, אין חובת ההבדלה אלא תקנת חכמים.
על פי ההלכה, מי שאמר הבדלה בתפילת ערבית, או לחלופין אמר "ברוך המבדיל בין קודש לחול", רשאי לעשות מלאכה לפני ההבדלה. אולם אסרו חכמים לאכול לפני ההבדלה.
מי שלא היה לו יין או מסיבה אחרת לא הבדיל במוצאי שבת, יכול להבדיל עד יום שלישי. במדינות הצפון, כמו נורבגיה, נוהגים בחודשי הקיץ להבדיל ביום ראשון בבוקר כיון שהשבת יוצאת בשעה מאוד מאוחרת.
יש לומר את ההבדלה על היין, וגם מיץ ענבים (המכונה בלשון חכמים "יין מגתו") כשר להבדלה. אולם כאשר אין יין ניתן לעשות הבדלה גם על משקאות משכרים אחרים. מספר פוסקי הלכה התירו לאמרה אף על משקאות אחרים כדוגמת קפה וחלב, אך רוב פוסקי ההלכה אוסרים זאת.